於氏為金壇望族，於敏中出身於詩禮簪纓世家。其曾祖父於嗣昌，乃明代萬歷進士於孔兼之孫，系順治十八年（1661年）進士，曾任山西襄垣知縣；祖父於漢翔，康熙二十壹年（1682年）進士，曾督陜西學政，風流文章，名噪壹時；父親於樹範，曾召入內廷充武英殿纂修，參與編輯《康熙字典》、《佩文韻府》等書，後調任浙江宣平知縣。於敏中幼年過繼給其叔於枋為嗣，於枋為雍正二年（1724年）進士，曾任翰林院編修，廣西、山東主考官。於枋後來得子，於敏中又歸其親生父母。
於敏中幼承家學，天資聰慧，五歲啟蒙，力學《四書》。其母親課讀甚嚴，經常立在窗下屏息靜聽其讀書。祖父於漢翔親授《大學》章句，使之能依集註解不謬。於敏中10歲時即通讀《五經》，認真評點。雍正七年（1729年），年僅15歲的於敏中應江寧鄉試，中式舉人。但首次赴京會試不期落第。回壇後重新擇師問業，拜同邑雍正癸卯進士王步青（字已山）為師，重新研讀《四書》及十三經。年及冠，博通經史百家、陰陽歷律諸書，旁及佛道之說。 乾隆二年（1737年），於敏中參加丁已恩科會試，擢進士第壹，時年23歲。從此，於敏中與其族兄於振並稱“兄弟狀元”，成為金壇科舉盛事。當年，他便入直翰林，授修撰，供職七年。以文翰受乾隆帝的賞識，直懋勤殿，累遷侍講，掌讀講經史，撰著朝事。
於敏中年少奪魁，春風得意。他文思敏捷，通熟掌故，文章冠絕壹時，書法亦清秀灑脫，且能熟練掌握漢、滿、蒙、梵多種語言文字。他初入懋勤殿時，乾隆帝曾令其譯抄佛教經典《華嚴》、《楞嚴》兩部經書，他先畫出壹座寶塔形狀，用小楷寫經，凡是欄柱檐瓦窗階鈴索之處都有字，宛轉依線，讀之成文。這還不算難，難在每有“佛”字，壹定要算定寫在柱頂或檐際的尊貴之處，不得亂填亂寫。為此軸《華嚴經寶塔》，於敏中排算了二年，寫了將近壹年，成了書法史上壹段佳話。他還集譯抄宣講於壹身，縱論政事，極為得體，深受乾隆帝贊賞。 乾隆九年（1744年），於敏中奉旨主持山西鄉試。乾隆十年（1775年），乾隆帝巡幸江南苑，問於敏中何為“治國要務策？”於敏中認為“治國要務莫過於興學得人，人才得即政事理。”乾隆帝點頭稱善，因此命其督山東、浙江學政。於敏中為朝廷選拔人才，建修學宮，革除積弊，頗得士林贊譽。後奉旨回京直上書房，教習皇子皇孫，督課教學，嚴謹善教，深得帝寵，累遷內閣學士。乾隆十五年（1780年），復督山東學政。乾隆十九年（1784年），擢為兵部侍郎。
乾隆二十壹年（1756年），其父於樹範去世，於敏中歸籍服喪。守制不久，乾隆二十二年（1757年），於敏中受特詔赴京署刑部左侍郎。孰料，乾隆二十三年（1758年），嗣父於枋亡故。此次治喪後不久，他的生母也去世了，於敏中只好戴喪辦喪。為了早日返回朝廷，於敏中向朝廷隱瞞了喪母壹事。禦史朱嵇知道此事後，立即疏劾於敏中將“兩次親喪，蒙混為壹，恝然赴官。”於敏中卻申辯說，在六部任職的大臣與戌守邊疆的將士沒有兩樣，不應該為家事而影響國家大事。乾隆帝也因其職任不可替代，惜其文才，原諒了他的這次過失，反而斥責朱嵇“汙人名節，不無過當”。當年年底，授於敏中戶部侍郎。
乾隆二十五年（1760年）十月，命於敏中為軍機大臣，從此直接參與機務朝事。於敏中年紀比乾隆帝小三歲，用事正當乾隆帝盛年，因此他行事檢點，大事小事都是謹慎奉旨而行，周密穩妥。乾隆帝作文賦詩，常常是即興而為，事先並無草稿。每次皇帝吟誦之後，於敏中便默記於心，然後再恭恭敬敬謄抄出來，壹字不差。有壹天早上，於敏中隨乾隆帝遊幸禦花園，乾隆即興賦詩七首作文二篇。夜裏，乾隆收到於敏中所記之言，欣賞之余不覺拍案驚奇，由此對其更加倚重。
乾隆三十年（1765年），擢戶部尚書。於敏中僅有壹子，名於齊賢，鄉試未能考中。乾隆考慮到其子已經長大，因此加恩予以依照尚書品級補為蔭生，入學國子監。又因於敏中正室夫人已經病故，特封其妾張氏為淑人。乾隆三十壹年（1766年），梁瑤峰進入軍機處，乾隆皇帝命其掌管詩文，而令於敏中專門負責國家政務。這樣，於敏中便可不再留心皇帝所作詩文了。壹日，皇帝召於敏中和梁瑤峰入宮，又吟誦詩文，於敏中趕緊給梁瑤峰使眼色，而梁瑤峰茫然不知其意。等到皇上吟誦完畢，二人出來，於敏中等待梁瑤峰將詩文謄寫出來，但好長時間都不見動靜，便問梁瑤峰皇上的詩文謄寫好沒有。梁這時才恍然大悟，不免驚慌失措。於敏中說，我以為妳是專管聖上詩文的，所以老夫便不再默記了。現在事已至此，妳看該怎麽辦呢？梁瑤峰非常慚愧，無言作答。於敏中長嘆壹聲道：讓我試著替妳回憶壹下吧。這樣，於敏中便默默地獨自壹人坐在屋裏仔細回想，不壹會兒便靠記憶全部背寫出來，全篇竟然只錯了壹個字。
乾隆三十三年（1768年），加太子太保。乾隆三十六年（1771年），於敏中升為協辦大學士兼戶部尚書。乾隆三十八年（1773年），於敏中又晉升為文華殿大學士兼戶部尚書、首席軍機大臣。無論是在朝廷，還是巡幸在外，他都是禦前須臾不可離開的最顯眼的人物。朝中的許多重要決策，有些就是皇帝采納他的意見作出的，當時他已是朝野盡知的京中第壹權臣。 乾隆三十九年（1776年），宮內太監高雲從泄露了乾隆帝朱批道府記載，乾隆帝命將其鎖拿交禦前大臣審訊。據高雲從招供，於敏中曾向他問及乾隆帝對觀亮評論的記載。另外還曾為自己買地受騙，懇求於敏中轉托蔣賜棨幫自己打官司。乾隆帝知道之後，非常惱火。於敏中誠惶誠恐，自責認罪，說高雲從確實曾面求轉托，而自己確實沒有答應。但不立即據實參奏，實屬錯謬。乾隆帝特發諭旨，嚴厲譴責道：“於敏中每日承蒙朕召，諸事應付，朕什麽話不能對他講？為什麽他還要轉向宮內太監探聽詢問有關消息呢？”並命將其交刑部嚴加議處。後來刑部議將革職，乾隆帝卻又親下詔書對他從寬處理，仍然將他繼續留任。
乾隆四十壹年（1778年），於敏中因平定大小金川之亂有功，乾隆帝下詔嘉獎，還給於敏中賞戴雙眼花翎，賜穿黃馬褂，並圖其像於紫光閣。乾隆四十四年（1779年），於敏中病喘臥床，乾隆帝隨遣禦醫視治。病重期間，諭內務大臣和珅伴帝駕親臨探視，贈送人參二支，賜其七律壹首。
同年十二月初八（1780年1月14日），於敏中因病逝世（《清史稿》懷疑於敏中是飲鴆自盡），享年66歲，乾隆帝下詔優賜恤，入祀賢良祠，謚“文襄”，歸葬金壇涑瀆周莊村。 乾隆四十五年（1780年）六月，於敏中的孫子於德裕到官府控告其堂叔於時和侵吞其祖父在京資產，於本年三月轉移回金壇。乾隆帝十分重視，命大學士阿桂、英廉查辦。由於於時和已先行回原籍，傳諭江蘇巡撫吳壇立即親赴金壇，查明於時和所占於敏中原籍家產。查辦的結果令人震驚，素有廉直之名的於敏中，其京中及原籍家產竟值銀二百萬兩。乾隆帝十分惱怒，認為於敏中巨額遺產“非得之以正者”。但仍然欲保全他的名節，諭示辦案大臣不必去追究於敏中生前之罪。此案經吳壇審明，於時和吞占家產屬實，將於時和發往伊犁充當苦差，其帶往原籍的於敏中遺貲，酌情給於德裕三萬余兩，其余全部充公留給金壇地方作開河費用。緊接著，蘇松糧道章攀桂私下為於敏中營造花園的事情被發覺。乾隆帝認為，於敏中受地方官員的逢迎，是情理中事，既然他已經去世，就不必追究了，僅僅將章攀桂革職處理。
乾隆四十六年（1781年），浙江巡撫王亶望、陜甘總督勒爾謹及甘肅通省官員在捐監折收之中捏災冒賑的貪汙大案敗露。經過壹年多的調查核實，***計處死正法者56犯，免死發遣者46犯，冒賑貪汙銀款達二百八十壹萬壹千三百五十余兩，涉嫌此案的甘省貪官無壹漏網。王亶望貪汙案處理之後，乾隆便立刻覺察出，釀成這起空前巨案的元兇還不是王亶望，而是不久前故去的於敏中。
乾隆四十七年（1782年）十月，當殺掉了最後壹批甘省貪官後，乾隆帝頒布了壹道洋洋千言的諭旨。上諭開頭便說，當年甘肅奏請恢復捐監時，“大學士於敏中管理戶部，即行議準。又以若準開捐，將來可省部撥之煩，巧言飾奏，朕誤聽其言，遂爾允行”，乾隆帝也承認了自己在這件事情上的失誤。諭旨接下來說，“其時王亶望為甘肅布政使，持有於敏中為之庇護”，以至放手大貪其汙。最後，諭旨筆鋒壹轉，說於敏中“宣年力久，且已身故”，“朕不忍追治其罪”！這壹道經過精心推敲的諭旨，再壹次將於敏中的罪責輕描淡寫地遮掩了過去。
乾隆五十壹年（1786）的二月初八，乾隆帝在把玩古董時，為了壹件明朝嘉靖年間的古瓷觸動了情思。他由嘉靖皇帝的昏庸想到權奸嚴嵩的專擅，又由嚴嵩而想起了於敏中。為此，乾隆再次頒發諭旨，指責於敏中借著皇帝恩眷，招權納賄，並聯系甘省貪汙大案，推斷“於敏中擁有厚貲，亦必系王亶望等賄求賂謝”。因此，將於敏中撤出賢良祠，以昭儆戒。