在10ml反應體系中，將磷32標記的uidA基因轉錄RNA、50 nm寡脫氧核苷酸、pH值為7.5的40 mmol Tris-HCl緩沖液、4 mmol氯化鎂、1 mmol DTT和5單位核酸酶H混合均勻，然後在37攝氏度下混合。通過加入5ml終止緩沖液終止反應。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%)分離反應產物，將凝膠置於wortmann濾紙上進行X射線檢測。每個寡脫氧核苷酸反應產物檢測兩次。
3.結果
3.1的體外分析。uidA信使RNA核酶
矽片中uidA信使RNA(1811 bp)的二級結構用RNAdraw(Matzura和Wennborg，1996)分析。根據NHH原理，在單鏈中包含GUC序列意味著它包含有效的核酶切割位點(Ohkawa等，65438)。Kore等人，1998)。在uidA信使RNA中鑒定了7個核酶切割位點。其中4個位於5V區(nt10，67，219，297)，2個位於中間區(nt476，762)，1個位於3V區(nt 1332；數據未顯示)。核酶作用於這些位點(rz4-rz10，詳見表1)進行轉錄，並定性檢測其轉錄uidA信使RNA的活性。在實驗中檢測了三種不同長度的uidA底物，即短Buida short q(NT 1-217)、中等大小的buidAmedQ(nt1-1090)和全長Buida Longq (NT 1-65438)。三種不同長度底物的RNA轉錄表明，隨著長度的增加，穩定性逐漸降低。Haendly和mccall (1996)的研究表明，同時加入較短的臂I(5 BP)和較長的臂III(10 bp)可以提高失活核酶的切割活性。為了分析粘性臂的長度對切割活性的影響，分別構建了核酶rz4和rz5，即在臂I和臂III上分別添加了10個粘性核苷酸的對稱型(rz4sym和rz5sym)和在臂I上分別添加了5個核苷酸和10個核苷酸的非對稱型(RZ4SYM和RZ5SYM)。圖3顯示了以短鏈uidA為底物的核酶以及對稱和不對稱核酶rz4和rz5的檢測結果。四個都有。