在這十幾年中，李時珍閱讀了大量古醫籍，又經過臨床實踐發現古代的本草書籍，“品數既煩，名稱多雜。或壹物析為二三，或二物混為壹品”（《明外史本傳》）。特別是許多毒性藥品，竟被認為可以“久服延年”，因而遺禍無窮。於是，他決心要重新編纂壹部本草書籍。三十壹歲那年，他就開始醞釀，為了“窮搜博采”，讀了大量參考書。家藏的書讀完了，就利用行醫的機會，向本鄉豪門大戶借。後來，進了武昌楚王府和北京太醫院，讀的書就更多，簡直成了“書迷”。他自述“長耽嗜典籍，若啖蔗飴”（《本草綱目》原序）。顧景星在《李時珍傳》裏，也贊他“讀書十年，不出戶庭，博學無所弗瞡”。確實如此，他不但讀了八百余種上萬卷醫書，而且看過不少歷史、地理和文學名著，敦煌的經史巨作，他遍讀了；幾個古代偉大詩人的全集也都仔細鉆研過。他還摘錄了大量有關醫藥學的詩句。這些詩句給了他許多真實有用的醫藥學知識，幫助他糾正了前人在醫藥學上的許多謬誤。如古代醫書中，常常出現“鶩與鳧”。它們指的是什麽？是否有區別？歷代藥物學家眾說紛紜，爭論不休。李時珍摘引屈原《離騷》中的“將與雞鶩爭食乎”，“將泛乎若水中之鳧乎”兩句，指出詩人把“鶩”與“鳧”對舉並稱，就是它們不是同壹種禽鳥的明證。他又根據詩中對它們不同生活環境的描繪，證明“鶩”是家鴨，“鳧”是野鴨子，藥性不同。屈原的詩賦，竟成了李時珍考證藥物名實的雄辯依據。
在編寫《本草綱目》的過程中，最使李時珍頭痛的就是由於藥名混雜，往往弄不清藥物的形狀生長的情況。過去的本草書，雖然作了反復的解釋，但是由於有些作者沒有深入實際進行調查研究，而是在書本上抄來抄去在“紙上猜度”，所以越解釋越糊塗，而且矛盾倍出，使人莫衷壹是。例如藥物遠誌，南北朝著名醫藥學家陶弘景說它是小草，象麻黃，但顏色青，開白花，宋代馬誌卻認為它象大青，並責備陶弘景根本不認識遠誌。又如狗脊壹藥，有的說它象萆薢，有的說它象拔葜，有的又說它象貫眾，說法很不壹致。類似此情況很多，李時珍不得不壹次又壹次擱下筆來。這些難題該怎樣解決呢？在他父親的啟示下，李時珍認識到，“讀萬卷書”固然需要，但“行萬裏路”更不可少。於是，他既“搜羅百氏”，又“采訪四方”，深入實際進行調查。
李時珍穿上草鞋，背起藥筐，在徒弟龐憲、兒子建元的伴隨下，遠涉深山曠野，遍訪名醫宿儒，搜求民間驗方，觀察和收集藥物標本。他首先在家鄉蘄州壹帶采訪。後來，他多次出外采訪。除湖廣外，還到過江西、江蘇、安徽好多地方。均州的太和山也到過。盛產藥材的江西廬山和南京的攝山、茅山、牛首山，估計也有他的足跡。後人為此寫了“遠窮僻壤之產，險探麓之華”的詩句，反映他遠途跋涉，四方采訪的生活。
李時珍每到壹地，就虛心向各式各樣的人物請求。其中有采藥的，有種田的，捕魚的，砍柴的，打獵的。熱情地幫助他了解各種各樣的藥物。
比如蕓苔，是治病常用的藥。但究竟是什麽樣的？《神農本草經》說不明白，各家註釋也搞不清楚。李時珍問壹個種菜的老人，在他指點下，又察了實物，才知道蕓苔，實際上就是油菜。這種植物，頭壹年下種，第二年開花，種子可以榨油，於是，這種藥物，便在他的《本草綱目》中壹清二楚地註解出來了。
在四處采訪中，或在自己的藥圃裏，李時珍都非常註意觀察藥物的形態和生長情況。蘄蛇，即蘄州產的白花蛇。這種藥有醫治風痹、驚搐、癬癩等功用。李時珍早就研究它。但開始，只從蛇販子那裏觀察。內行人提醒他，那是從江南興國州山裏捕來的，不是真的蘄蛇。那麽真正蘄蛇的樣子又是怎麽樣的呢？他請教壹位捕蛇的人。那人告訴他，蘄蛇牙尖有劇毒。人被咬傷，要立即截肢，否則就中毒死亡。在治療上述諸病有特效，因之非常貴重。州官逼著群眾冒著生命危險去捉，以便向皇帝進貢。蘄州那麽大，其實只有城北龍峰山上才有真正的蘄蛇。李時珍追根究底，要親眼觀察蘄蛇，於是請捕蛇人帶他上了龍峰山上。那裏有個狻猊洞，洞周圍怪石嶙峋，灌木叢生。纏繞在灌木上的石南藤，舉目皆是。蘄蛇喜歡吃石南藤的花葉，所以生活在這壹帶。李時珍置危險於度外，到處尋找。在捕蛇人的幫助下，終於親眼看見了蘄蛇，並看到了捕蛇、制蛇的全過程。由於這樣深入實際調查過，後來他在《本草綱目》寫到白花蛇時，就得心應手，說得簡明準確。說蘄蛇的形態是：“龍頭虎口，黑質白花、脅有二十四個方勝文，腹有念珠斑，口有四長牙，尾上有壹佛指甲，長壹二分，腸形如連珠”；說蘄蛇的捕捉和制作過程是：“多在石南藤上食其花葉，人以此尋獲。先撒沙土壹把，則蟠而不動，以叉取之。用繩懸起， 刀破腹去腸物，則反尾洗滌其腹，蓋護創爾，乃以竹支定，屈曲盤起，紮縛炕幹。”同時，也搞清了蘄蛇與外地白花蛇的不同地方：“出蘄地者，雖幹枯而眼光不陷，他處者則否矣。”這樣清楚地敘述蘄蛇各種情況，當然是得力於實地調查的細致。
李時珍了解藥物，並不滿足於走馬看花式的調查，而是壹壹采視，對著實物進行比較核對。這樣弄清了不少似是而非、含混不清的藥物。用他的話來說，就是“壹壹采視，頗得其真”，“羅列諸品，反復諦視”
當時，太和山五龍宮產的“榔梅”，被道士們說成是吃了“可以長生不老的仙果”。他們每年采摘回來，進貢皇帝。官府嚴禁其他人采摘。李時珍不信道士們的鬼話，要親自采來試試，看看它究竟有什麽攻效。於是，他不顧道士們的反對，竟冒險采了壹個。經研究，發現它的功效跟普通的桃子、杏子壹樣，能生津止渴而已，是壹種變了形的榆樹的果實，並沒有什麽特殊攻效。
鯪鯉，即今天說的穿山甲，是常用的中藥。陶弘景說它能水陸兩棲，白天爬上巖來，張開鱗甲，裝出死了的樣子，引誘螞蟻進入甲內，再閉上鱗甲，潛入水中，然後開甲讓螞蟻浮出，再吞食。為了了解陶弘景的說法是否對頭，李時珍親自上山去觀察。並在樵夫、獵人的幫助下，捉到了壹只穿山甲。從它的胃裏剖出了壹升左右的螞蟻，證實穿山甲動物這點，陶弘景是說對了。不過，從觀察中，他發現穿山甲食蟻時，是搔開蟻穴，進行舐食，而不是誘蟻入甲，下水吞食，李時珍肯定了陶弘景對的壹面，糾正了其錯誤之處。
就這樣，李時珍經過長期的艱苦的實地調查，搞清了藥物的許多疑難問題，於萬歷戊寅年（公元壹五七八年）完成了《本草綱目》編寫工作。全書約有190萬字，五十二卷，載藥壹千八百九十二種，新增藥物三百七十四種，載方壹萬多個，附圖壹千多幅，成了我國藥物學的空前巨著。其中糾正前人錯誤甚多，在動植物分類學等許多方面有突出成就，並對其他有關的學科（生物學、化學、礦物學，地質學，天文學等等）也做出貢獻。達爾文稱贊它是“中國古代的百科全書”。