下圖顯示了基因組組裝的重要裏程碑。不同的顏色背景顯示了從最早的基於核苷酸的早期測序到基於Sanger的鳥槍法測序，再到大規模的第二代NGS測序，再到目前的第三代TGS測序的主要組裝成就。歷時13年（1990-2003）耗資30億美元的人類基因組計劃（HGP）無疑加速了基因組組裝的進程。NGS衍生了壹系列新的應用，包括全外顯子測序、RNA-seq、ChIp-seq、WGBS-seq等，極大地促進了基因組測序的應用。2010年後，全新的技術開啟了第三代測序TGS的時代——長閱讀和長測序，極大地增加了基因組組裝的優勢，極大地提高了基因組組裝的連續性。
TGS的定義可能有所不同，它通常是指不經擴增直接對單個DNA分子進行測序的技術。這些技術產生比NGS更長的讀取，每次讀取可以跨越幾千到幾百千位/秒。NGS技術如10X基因組學關聯閱讀和Hi-C可以改善基因組組裝的連續性，但TGS的出現使改善組裝的連續性變得更容易。
目前，三代測序技術被廣泛應用，壹種是由太平洋生物科學公司（Pacific bio）完善並商業化的單分子實時測序技術（SMRT），另壹種是由牛津納米孔技術公司（ONT）商業化的納米孔測序技術。SMRT測序技術應用了邊合成邊測序的原理。以SMRT芯片為測序載體，載體上分布著數百萬個納米級零模波導孔（ZMW）。每個ZMW中的聚合酶捕獲文庫的DNA序列，dNTP被熒光激發，從而根據捕獲的熒光信號的長度在合成的同時進行測序。目前，SMRT測序有兩種模式，壹種是連續長閱讀（CLR）模式，另壹種是循環共有序列（CCS）模式。CLR的閱讀長度更長，但堿基測序的錯誤率更高（90%的準確率遠低於NGS的99.9%），但測序錯誤完全是隨機的。CCS模式利用這壹特性，通過自校正將時序控制錯誤率降至NGS水平，而CLR則犧牲了時序控制讀取長度。
納米孔測序使用插入人工脂質雙層中的轉基因細菌納米孔，這些納米孔被放置在寬度為幾十微米的單個微孔中，並排列在傳感器芯片上。當每個單鏈DNA通過壹個通道時，它會幹擾流過孔的電流，這種變化將由半導體傳感器測量。不同的堿基破壞電場的方式略有不同，記錄的電流變化可以轉化為DNA序列。ONT可以讀取的長度更長，這取決於制備的DNA文庫的大小，但其堿基準確性很難糾正，測序錯誤率也很高。
第三代測序技術由於其較長的閱讀長度，可以有效地跨越基因組中的復雜區域，從而顯著提高基因組組裝的質量。此外，在二倍體（多倍體）基因組中，TGS可以更容易地產生單倍型長時相塊，區分來自父母的遺傳信息，避免嵌合基因組，並有助於準確檢測結構變異（SV），包括高度重復區域的長變異、大插入缺失、重復、倒位和易位。同時，第三代測序還可以通過PacBio的酶促動力學反應或納米孔中的離子電流信號實現表觀遺傳測序。
FALCON是壹款基於三代數據的從頭組裝軟件，由PacBio直接開發並於2013發布。它繼承了分層基因組組裝（HGAP）過程。首先，對序列本身進行比較，以糾正三代測序的讀數準確性，然後使用德布魯金圖（DBG）構建重疊群，如下圖所示。FALCON可以識別二倍體序列，並可以輸出包含位點變異信息的等位基因序列（備選重疊群/a-重疊群）和主要基因組序列（主要重疊群/p-重疊群）。FALCON-Unzip是FALCON的升級版，它可以使用初始組裝中識別的雜合SNP獲得高度相合的單倍型，然後使用Hi-C數據繪制到組裝體上，並使用haplotigs和* * *序列完全組裝兩個單倍型。
Canu是源於Celera Assember的三代組裝軟件，可用於PacBio和Nanopore獲得的測序結果。它是以重疊-布局-共識（OLC）的方式組裝的，即利用長序列之間的重疊，主要分為三個步驟:糾錯、剪枝和組裝。對於FALCON來說，盡管與短閱讀長度相比，組裝前的錯誤糾正有了很大的改善，但組裝的單倍型仍然是嵌合的，重復的序列經常折疊成壹個序列。為了解決這個問題，2018發布的新版本軟件TrioCanu可以通過使用父母信息來完全相位單倍型。它利用雙親的第二代illumina數據，在組裝前根據不同的SNPs對組裝樣本的序列進行分類，然後從雙親中獨立組裝出兩套單倍型，因此TrioCanu特別適用於高雜合性基因組組裝。
Canu的計算速度很慢。HiFiasm是近兩年開發的用於PacBio HiFi reads的快速單體型分析從頭組裝軟件。它可以在壹臺機器上多線程運行，以較少的資源消耗快速完成基因組組裝，同時，利用給定的親本數據實現不同親本後代的單倍型組裝。但是單倍型分型的準確性比TrioCanu稍差。
裝配結果的準確性和計算工作的優化都是裝配中需要考慮的方面。目前，已經開發了多種用於從頭組裝的軟件，包括Wtdbg2、Flye、Peregrine、Shasta等。相對較快，但其裝配質量可能不太精確。所有基因組組裝方法和軟件都有優點和缺點。在實際應用中，我們可以考慮實際的組裝物種、排序策略和組裝目標，並綜合考慮選擇準確和優秀的組裝軟件。
對於大型基因組來說，即使是長閱讀也無法跨越整個染色體序列，需要其他連鎖信息來定位和測序組裝的重疊組，從而將基因組組裝提升到Scanfold的水平。生物納米光學圖譜是壹種單分子DNA技術。該方法基於DNA標記生成遺傳光學圖譜，然後與初始組裝的重疊組結合，可以進壹步對重疊組進行定相和測序，並產生更長的支架。此外，Bionano光譜還可用於SV和甲基化分析。
另壹種對重疊群進行定向和排序的技術是基於染色體構象捕獲（3C）（Hi-C）。Hi-C技術首先使用甲醛固定染色體的空間構象，然後使用限制性內切酶處理DNA並重新連接空間相鄰的DNA分子。該技術利用基因組的空間信息，結合重疊組和支架將其分布到染色體水平。Hi-C是目前在大基因組中實現染色體水平支架的唯壹方法，但它往往不如Bionano支架保守。染色質不可預測的折疊導致染色體遙遠區域的相互作用，這可能導致組裝錯誤，如人工倒位、同壹染色體中的支架錯位或不同染色體中的支架錯配。綜合利用不同的技術可以更好地糾正這些錯誤，甚至獲得整個染色體的端粒到端粒組裝。
基因組組裝的方式壹直在不斷創新和優化。通過不斷改進現有技術並引入新的DNA測序方法和生物信息學工具，組裝質量壹直在提高。NGS引入的高通能力和TGS提供的更高質量的序列最終使復雜的基因組可用於全基因組研究。人類遺傳學研究，包括群體基因組學、遺傳病定位和診斷、個性化醫療規劃、癌癥研究和產前檢測，都受益於過去十年基因組測序和組裝的進展。同樣，這些方法越來越多地用於非模式生物，以了解生態和進化過程。參考基因組測序和組裝的承諾已從單物種項目擴展到多物種協調，旨在通過結合NGS和TGS方法為大多數生物產生高質量基因組的項目目前正在進行中。
賈尼AM，加洛GR，吉安弗朗切斯基L，福門蒂g .基因組學的漫漫長路:基因組測序和組裝的歷史和當前方法。計算機結構生物技術雜誌2065438+2009年11月65438+2007；18:9-19.doi:10.1016/j . csbj . 2019.11.002。PMID:31890139；PMCID: PMC6926122。