HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和氫供體(DH2)。大多數氫供體是無色的還原染料，通過反應可以生成有色的氧化染料(D)。酶促反應的過程如下:
醫院資源規劃（Hospital Resource Planning的縮寫）
DH2+H2O 2───→D+2H2O
目前，廣泛使用和令人滿意的供氫體是OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。
DAB(3.3 -二氨基聯苯胺)的反應產物為電子密度不溶的沈澱，適用於免疫酶染色或電鏡觀察。
5AS(5-氨基水楊酸)早期用於ELISA，但溶解度不夠大，空白孔不易控制到無色，現在很少使用。
OT(鄰甲苯胺)能生成明亮的藍綠色產物，靈敏度高，但在反應中受溫度影響較大，由於產物不穩定，需要在短時間內測定。
目前，應用廣泛且令人滿意的供氫體有:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深橙色或棕色，後者的產物為藍綠色。兩者都具有良好的溶解性，在黑暗中顏色穩定，空白可近無色。據報道，後者的靈敏度比前者高4倍以上。
此外，還有壹個氫供體叫ABTS[2，？2’-芳基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6磺酸)]，其反應產物為藍綠色，靈敏度和穩定性良好。特別是在致癌潛力方面，ABTS和TMB都值得被選為供氫體。