宋徽宗大觀二年(公元1108年)，命四川名醫唐慎微對《本草》加以修改、增補，史稱《證類本草》。該書收藏藥物1558種，附藥方3000余個。人們壹直對這本書推崇備至。
李時珍對《神農本草經集註》、《唐本草》及《證類本草》等藥物學方面的巨著都壹壹進行了認真仔細的閱讀和研究。壹方面他敬慕前人的研究成果；另壹方面也發現了這些著作中還存在壹些理論上和觀察上的錯誤，有必要加以整理和糾正。
再則，從宋代修訂《證類本草》到李時珍生活的明代，歷史又前進了500多年。外藥的輸入，加上金元以來藥物學方面諸種流派之間的爭論使醫藥理論得到較大的提高。再者，民間慣用藥方的遺失也必將盡快補上。所有這壹切都需要加以整理，寫入新的藥著之中，這個重擔就落在了李時珍肩上。
基於以上的認識，年僅二十幾歲的李時珍立誌把舊的藥書加以整理、補充、寫出壹部分類更加詳細的藥物學著作。但他心中十分清楚，要重新修訂《本草》，力求在前人的基礎上有所突破和發展並非易事。為此，他開始了長達數十年的準備工作。
為了繼承前人的科學成果，李時珍查閱了浩如煙海的歷史典籍、醫學名著和各種《本草》。除了仔細精讀各朝《本草》外，李時珍還廣泛閱讀了各種醫著、方書等，如《黃帝內經·素問》、《黃帝內經·靈樞》、《張仲景傷寒論》、《扁鵲方》、《華佗方》、《張仲景金匱五函方》、《唐玄宗開元廣濟方》、《天寶單方圖》、《宋太宗太平聖惠方》等二百七十七家。並對這些著作中的內容進行了審查、核對、分析、判斷。在大量閱讀醫藥典籍的同時，李時珍還翻閱了許多古今經史和稗官小說。
大約在1556年(明嘉靖三十五年)，禮部命令各地舉選醫學人才集中到北京，以補充太醫院的缺額。湖廣保送了壹批著名的醫生，李時珍也是其中之壹。
李時珍到了北京後，雖然沒有得到統治者的重用，但太醫院豐富的藏書，來自海內外的各種藥物，使他獲益匪淺。他還多次到藥王廟仔細辨識銅人模型的人身腧穴，熟悉了人體所有的腧穴及各經絡的理路，為他撰寫《奇經八脈考》等書打下了基礎。太醫院的壽藥房、禦藥庫也是李時珍經常光顧的地方，在那裏他對來自不同地區的各種藥物壹壹加以比較研究，積累了辨識藥物的豐富經驗。
李時珍在太醫院時，幾次向朝廷申奏要求支持他編修《本草綱目》壹書，但都如泥牛沈海毫無反應。於是他托疾辭去了太醫院的職務，踏上了南歸的道路，決心自己獨立完成編纂《本草綱目》的工作。
編纂壹本規模宏大的藥物學著作單有豐富的理論知識是遠遠不夠的。當撰寫工作開始時，李時珍把搜集到的材料按自己制定的分類方法，逐條進行編寫，但隨著研究的深入，他感到困難越來越多，最使他感到茫然的是許多藥物的形狀和生長情況在古人的書籍裏往往模糊不清，有的甚至互相矛盾。經過壹番苦思冥想，李時珍終於認識到，要解決這些問題，惟壹的途徑是深入民間，采制標本，搞實物考察。
李時珍的足跡踏遍了蘄春壹帶的山山水水，近的如缺齒山、遠的如丫頭山、大的如紫雲洞、小的如朱家洞，都成了他奔走訪問的對象。他對山中的甘菊、苦參、紫蘇、蒼耳……及土蜂、蟾蜍、竹難、野豬等都進行了仔細的觀察和研究。
為了采制有價值的標本，徹底弄清楚古人所述的各類藥物，李時珍到過武當山采藥，也去過盛產藥材的攝山、茅山、牛首山等地。他登山梁，下河谷，踏原野，去水鄉，足跡遍布湖廣、江西、江蘇、安徽等省。
在尋訪四方的過程中，李時珍交了壹大批民間朋友，並從他們那兒得到了許多書本上學不來的知識。他遇農民，便問五谷的生態和屬性；逢漁夫，就打聽魚蝦鱉蟹的捕捉和食用；見到獵人，則詢問野獸飛禽的生活習性和藥用價值；碰到樵夫，便聊起植物的形態與采摘季節；向藥農請教藥材的采集和泡制；向果農了解瓜果的種植嫁接和品種滋味。通過廣泛的請教和親身實地考察，李時珍糾正了許多前人的錯誤觀點。
為徹底弄清藥物的功效，李時珍常以身試藥，有幾次甚至差點中毒身亡。