明世宗嘉靖三十壹年（1552年），李時珍著手開始編寫《本草綱目》，以《證類本草》為藍本，參考了800多部書籍，其間，從嘉靖四十四年（1565年）起，多次離家外出考察，足跡遍及湖廣、江西、直隸許多名山大川，弄清了許多疑難問題。
在編寫《本草綱目》的過程中，最使李時珍頭痛的就是由於藥名混雜，往往弄不清藥物的形狀和生長的情況。過去的本草書，雖然作了反復的解釋，但是由於有些作者沒有深入實際進行調查研究，而是在書本上抄來抄去，所以越解釋越糊塗，而且矛盾百出，使人莫衷壹是。
在他父親的啟示下，李時珍認識到，“讀萬卷書”固然需要，但“行萬裏路”更不可少。於是，他既“搜羅百氏”，又“采訪四方”，深入實際進行調查。
經過27年的長期努力，於明神宗萬歷六年（1578年）完成《本草綱目》初稿，時年61歲。以後又經過10年三次修改，前後***計40年。萬歷二十壹年（公元1593年）去世。萬歷二十五年（1596年），也就是李時珍逝世後的第三年，《本草綱目》在金陵（今南京）正式刊行。
李時珍的個人著述
李時珍的著作尚有《奇經八脈考》《瀕湖脈學》傳世；還有《命門考》《瀕湖醫案》《五臟圖論》《三焦客難》《天傀論》《白花蛇傳》等，皆佚。
李時珍感其時代的中醫脈學存有缺憾甚至謬誤繁多，便依其父李月池所著《四診發明》及歷史上其他多家脈論精華，於1564年（明嘉靖四十三年）編著成《脈訣》，即《瀕湖脈學》。
《瀕湖脈學》為李時珍晚年所著，以號命書，是為“瀕湖脈學”。《瀕湖脈學》語言簡明，論脈清澈，不但把臨床復雜脈象總結歸納成基本的27種脈象，而且還把主要內容，即脈象、相類脈鑒別、脈象主病，皆以韻文歌括形式撰述，便宜誦記，因此上其書流傳深廣，歷來受醫家推崇。